BDDE குறுக்கு-இணைக்கப்பட்ட ஆட்டோகிளேவில் புதிய எதிர்வினை துணை தயாரிப்புகளைக் கண்டறிதல்

தற்போது உங்கள் உலாவியில் Javascript முடக்கப்பட்டுள்ளது.ஜாவாஸ்கிரிப்ட் முடக்கப்பட்டால், இந்த இணையதளத்தின் சில செயல்பாடுகள் இயங்காது.
Javier Fidalgo, * Pierre-Antoine Deglesne, * Rodrigo Arroyo, * Lilian Sepúlveda, * Evgeniya Ranneva, Philipe Deprez அறிவியல் துறை, ஸ்கின் டெக் பார்மா குழுமம், Castello D'Empúries, Catalonia, Spain * இந்த ஆசிரியர்கள் சில சமயங்களில் இந்த பணிகளைச் செய்துள்ளனர். பங்களிப்பு பின்னணி: ஹைலூரோனிக் அமிலம் (HA) என்பது இயற்கையாக நிகழும் பாலிசாக்கரைடு ஆகும்.மனித திசுக்களில் பல நாட்கள் அரை ஆயுளைக் கொண்டிருப்பதால், HA- அடிப்படையிலான தோல் நிரப்பிகள் உடலில் தங்கள் ஆயுளை நீட்டிக்க வேதியியல் ரீதியாக மாற்றியமைக்கப்படுகின்றன.வணிக ரீதியான HA-அடிப்படையிலான நிரப்புகளில் மிகவும் பொதுவான மாற்றம் 1,4-பியூட்டானெடியோல் டிக்ளைசிடில் ஈதரை (BDDE) HA சங்கிலிகளை குறுக்கு இணைப்பு முகவராகப் பயன்படுத்துவதாகும்.எஞ்சிய அல்லது செயல்படாத BDDE நச்சுத்தன்மையற்றதாகக் கருதப்படுகிறது <2 பகுதிகள் ஒரு மில்லியனுக்கு (பிபிஎம்);எனவே, நோயாளியின் பாதுகாப்பை உறுதி செய்வதற்காக இறுதி தோல் நிரப்பியில் எஞ்சியிருக்கும் BDDE அளவிடப்பட வேண்டும்.பொருட்கள் மற்றும் முறைகள்: திரவ குரோமடோகிராபி மற்றும் மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி (LC-MS) ஆகியவற்றை இணைப்பதன் மூலம் கார நிலைமைகளின் கீழ் BDDE மற்றும் HA இடையே குறுக்கு-இணைக்கும் எதிர்வினையின் துணை தயாரிப்பு கண்டறிதல் மற்றும் குணாதிசயத்தை இந்த ஆய்வு விவரிக்கிறது.முடிவுகள்: வெவ்வேறு பகுப்பாய்வுகளுக்குப் பிறகு, HA-BDDE ஹைட்ரஜலை கிருமி நீக்கம் செய்யப் பயன்படுத்தப்படும் கார நிலைமைகள் மற்றும் அதிக வெப்பநிலை இந்த புதிய துணை தயாரிப்பு, "புரோப்பிலீன் கிளைகோல் போன்ற" கலவை உருவாவதை ஊக்குவித்தது.LC-MS பகுப்பாய்வு, துணை தயாரிப்பு BDDE போன்ற அதே மோனோஐசோடோபிக் நிறை, வேறுபட்ட தக்கவைப்பு நேரம் (tR) மற்றும் வேறுபட்ட UV உறிஞ்சுதல் (λ=200 nm) பயன்முறையை உறுதிப்படுத்தியது.BDDE போலல்லாமல், LC-MS பகுப்பாய்வில் அதே அளவீட்டு நிலைமைகளின் கீழ், இந்த துணை தயாரிப்பு 200 nm இல் அதிக கண்டறிதல் விகிதத்தைக் கொண்டுள்ளது.முடிவு: இந்த புதிய கலவையின் கட்டமைப்பில் எபோக்சைடு இல்லை என்பதை இந்த முடிவுகள் குறிப்பிடுகின்றன.வணிக நோக்கங்களுக்காக HA-BDDE ஹைட்ரஜல் (HA டெர்மல் ஃபில்லர்) உற்பத்தியில் காணப்படும் இந்த புதிய துணை தயாரிப்பின் அபாயத்தை மதிப்பிடுவதற்கு விவாதம் திறந்திருக்கும்.முக்கிய வார்த்தைகள்: ஹைலூரோனிக் அமிலம், HA டெர்மல் ஃபில்லர், குறுக்கு-இணைக்கப்பட்ட ஹைலூரோனிக் அமிலம், BDDE, LC-MS பகுப்பாய்வு, BDDE துணை தயாரிப்பு.
ஹைலூரோனிக் அமிலம் (HA) அடிப்படையிலான ஃபில்லர்கள் ஒப்பனை நோக்கங்களுக்காகப் பயன்படுத்தப்படும் மிகவும் பொதுவான மற்றும் பிரபலமான தோல் நிரப்பிகள் ஆகும்.1 இந்த டெர்மல் ஃபில்லர் ஒரு ஹைட்ரஜல் ஆகும், இது பொதுவாக >95% நீர் மற்றும் 0.5-3% HA ஆகியவற்றால் ஆனது, இது அவர்களுக்கு ஜெல் போன்ற அமைப்பை அளிக்கிறது.2 HA என்பது ஒரு பாலிசாக்கரைடு மற்றும் முதுகெலும்புகளின் எக்ஸ்ட்ராசெல்லுலர் மேட்ரிக்ஸின் முக்கிய அங்கமாகும்.பொருட்களில் ஒன்று.இது (1,4)-குளுகுரோனிக் அமிலம்-β (1,3)-N-அசிடைல்குளுக்கோசமைன் (GlcNAc) கிளைகோசிடிக் பிணைப்புகளால் இணைக்கப்பட்ட மீண்டும் மீண்டும் வரும் டிசாக்கரைடு அலகுகளைக் கொண்டுள்ளது.இந்த டிசாக்கரைடு முறை அனைத்து உயிரினங்களிலும் ஒரே மாதிரியாக உள்ளது.சில புரத அடிப்படையிலான நிரப்பிகளுடன் (கொலாஜன் போன்றவை) ஒப்பிடும்போது, ​​இந்தப் பண்பு HA ஐ மிகவும் உயிரி இணக்கமான மூலக்கூறாக மாற்றுகிறது.நோயாளியின் நோயெதிர்ப்பு மண்டலத்தால் அங்கீகரிக்கப்படும் அமினோ அமில வரிசை தனித்தன்மையை இந்த நிரப்பிகள் வெளிப்படுத்தலாம்.
ஒரு தோல் நிரப்பியாகப் பயன்படுத்தப்படும்போது, ​​HA இன் முக்கிய வரம்பு ஹைலூரோனிடேஸ்கள் எனப்படும் நொதிகளின் குறிப்பிட்ட குடும்பத்தின் இருப்பு காரணமாக திசுக்களுக்குள் அதன் விரைவான விற்றுமுதல் ஆகும்.இதுவரை, HA கட்டமைப்பில் பல இரசாயன மாற்றங்கள் திசுக்களில் HA இன் அரை ஆயுளை அதிகரிக்க விவரிக்கப்பட்டுள்ளன.3 இந்த மாற்றங்களில் பெரும்பாலானவை HA சங்கிலிகளை குறுக்கு-இணைப்பதன் மூலம் பாலிசாக்கரைடு பாலிமர்களுக்கு ஹைலூரோனிடேஸின் அணுகலைக் குறைக்க முயற்சிக்கின்றன.எனவே, பாலங்களின் உருவாக்கம் மற்றும் HA அமைப்புக்கும் குறுக்கு-இணைக்கும் முகவருக்கும் இடையே உள்ள மூலக்கூறு கோவலன்ட் பிணைப்புகள் காரணமாக, குறுக்கு-இணைக்கப்பட்ட HA ஹைட்ரஜல் இயற்கையான HA ஐ விட அதிக நொதி சிதைவு தயாரிப்புகளை உருவாக்குகிறது.4-6
இதுவரை, குறுக்கு இணைக்கப்பட்ட HA ஐ உற்பத்தி செய்யப் பயன்படுத்தப்படும் இரசாயன குறுக்கு இணைப்பு முகவர்களில் மெதக்ரிலாமைடு, 7 ஹைட்ராசைடு, 8 கார்போடைமைடு, 9 டிவினைல் சல்போன், 1,4-பியூட்டானெடியோல் டிக்ளைசிடில் ஈதர் (BDDE) மற்றும் பாலி(எத்திலீன் கிளைகோல்) டைக்ளிசைடில் ஈதர் ஆகியவை அடங்கும்.10 ,11 BDDE தற்போது மிகவும் பொதுவாக பயன்படுத்தப்படும் குறுக்கு இணைப்பு முகவர்.இந்த வகையான ஹைட்ரஜல்கள் பல தசாப்தங்களாக பாதுகாப்பானவை என்று நிரூபிக்கப்பட்டாலும், பயன்படுத்தப்படும் குறுக்கு இணைப்பு முகவர்கள் சைட்டோடாக்ஸிக் மற்றும் சில சந்தர்ப்பங்களில், பிறழ்வு ஏற்படக்கூடிய எதிர்வினை எதிர்வினைகள் ஆகும்.12 எனவே, இறுதி ஹைட்ரஜலில் அவற்றின் எஞ்சிய உள்ளடக்கம் அதிகமாக இருக்க வேண்டும்.எஞ்சிய செறிவு ஒரு மில்லியனுக்கு 2 பாகங்களுக்கு (பிபிஎம்) குறைவாக இருக்கும்போது BDDE பாதுகாப்பானதாகக் கருதப்படுகிறது.4
HA ஹைட்ரோஜெல்களில் குறைந்த-எச்சம் BDDE செறிவு, குறுக்கு-இணைப்பு பட்டம் மற்றும் மாற்று நிலை ஆகியவற்றைக் கண்டறிய பல முறைகள் உள்ளன, அதாவது வாயு குரோமடோகிராபி, மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி (MS), நியூக்ளியர் மேக்னடிக் ரெசோனன்ஸ் (NMR) ஃப்ளோரசன்ஸ் அளவீட்டு முறைகள், மற்றும் டையோடு வரிசை இணைந்த உயர் செயல்திறன் திரவ குரோமடோகிராபி (HPLC).13-17 இந்த ஆய்வு BDDE மற்றும் HA கார நிலைமைகளின் கீழ் வினையால் உற்பத்தி செய்யப்படும் இறுதி குறுக்கு-இணைக்கப்பட்ட HA ஹைட்ரஜலில் ஒரு துணை தயாரிப்பு கண்டறிதல் மற்றும் குணாதிசயத்தை விவரிக்கிறது.HPLC மற்றும் திரவ குரோமடோகிராபி-மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி (LC-MS பகுப்பாய்வு).BDDE இன் இந்த துணை தயாரிப்பின் நச்சுத்தன்மை தெரியவில்லை என்பதால், இறுதி தயாரிப்பில் BDDE இல் வழக்கமாகச் செய்யப்படும் முறையைப் போலவே அதன் எச்ச அளவீடும் தீர்மானிக்கப்பட வேண்டும் என்று பரிந்துரைக்கிறோம்.
HA இன் பெறப்பட்ட சோடியம் உப்பு (Shiseido Co., Ltd., Tokyo, Japan) மூலக்கூறு எடை ~1,368,000 Da (Laurent முறை) 18 மற்றும் உள்ளார்ந்த பாகுத்தன்மை 2.20 m3/kg.குறுக்கு இணைப்பு எதிர்வினைக்காக, BDDE (≥95%) சிக்மா-ஆல்ட்ரிச் கோ. (St. Louis, MO, USA) இலிருந்து வாங்கப்பட்டது.சிக்மா-ஆல்ட்ரிச் நிறுவனத்திடமிருந்து pH 7.4 உடன் பாஸ்பேட் பஃபர் செய்யப்பட்ட உமிழ்நீர் வாங்கப்பட்டது.LC-MS பகுப்பாய்வில் பயன்படுத்தப்படும் அனைத்து கரைப்பான்கள், அசிட்டோனிட்ரைல் மற்றும் நீர் ஆகியவை HPLC தர தரத்தில் இருந்து வாங்கப்பட்டன.ஃபார்மிக் அமிலம் (98%) ரியாஜென்ட் தரமாக வாங்கப்படுகிறது.
அனைத்து சோதனைகளும் யுபிஎல்சி அக்விட்டி சிஸ்டத்தில் (வாட்டர்ஸ், மில்ஃபோர்ட், எம்ஏ, யுஎஸ்ஏ) செய்யப்பட்டு, எலக்ட்ரோஸ்ப்ரே அயனியாக்கம் மூலத்துடன் (ஏபி எஸ்சிஐஎக்ஸ், ஃப்ரேமிங்ஹாம், எம்ஏ, யுஎஸ்ஏ) பொருத்தப்பட்ட ஏபிஐ 3000 டிரிபிள் குவாட்ரூபோல் மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமீட்டருடன் இணைக்கப்பட்டது.
குறுக்கு-இணைக்கப்பட்ட HA ஹைட்ரோஜெல்களின் தொகுப்பு 198 mg BDDE ஐ 10% (w/w) சோடியம் ஹைலூரோனேட் (NaHA) கரைசலில் 1% ஆல்காலி (சோடியம் ஹைட்ராக்சைடு, NaOH) முன்னிலையில் சேர்ப்பதன் மூலம் தொடங்கப்பட்டது.எதிர்வினை கலவையில் இறுதி BDDE செறிவு 9.9 mg/mL (0.049 mM) ஆகும்.பின்னர், எதிர்வினை கலவை முற்றிலும் கலக்கப்பட்டு ஒரே மாதிரியானது மற்றும் 4 மணி நேரம் 45 ° C இல் தொடர அனுமதிக்கப்படுகிறது.19 எதிர்வினையின் pH ~12 இல் பராமரிக்கப்படுகிறது.
அதன்பிறகு, எதிர்வினை கலவை தண்ணீரில் கழுவப்பட்டு, இறுதி HA-BDDE ஹைட்ரஜல் 10 முதல் 25 mg/mL வரை HA செறிவு மற்றும் 7.4 இன் இறுதி pH ஐ அடைய பிபிஎஸ் இடையகத்துடன் வடிகட்டப்பட்டு நீர்த்தப்பட்டது.உற்பத்தி செய்யப்பட்ட குறுக்கு-இணைக்கப்பட்ட HA ஹைட்ரோஜெல்களை கிருமி நீக்கம் செய்வதற்காக, இந்த ஹைட்ரஜல்கள் அனைத்தும் ஆட்டோகிளேவ் செய்யப்படுகின்றன (20 நிமிடங்களுக்கு 120 ° C).சுத்திகரிக்கப்பட்ட BDDE-HA ஹைட்ரஜல் பகுப்பாய்வு வரை 4 ° C இல் சேமிக்கப்படுகிறது.
குறுக்கு-இணைக்கப்பட்ட HA தயாரிப்பில் உள்ள BDDE ஐ பகுப்பாய்வு செய்ய, 240 mg மாதிரி எடைபோடப்பட்டு மைய துளைக்குள் அறிமுகப்படுத்தப்பட்டது (Microcon®; Merck Millipore, Billerica, MA, USA; volume 0.5 mL) மற்றும் அறை வெப்பநிலையில் 10,000 rpm இல் மையவிலக்கு செய்யப்பட்டது. 10 நிமிடம்.மொத்தம் 20 µL புல்-டவுன் திரவம் சேகரிக்கப்பட்டு பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது.
கார நிலைகளில் (1%, 0.1% மற்றும் 0.01% NaOH) BDDE தரநிலையை (Sigma-Aldrich Co) பகுப்பாய்வு செய்வதற்காக, பின்வரும் நிபந்தனைகள் பூர்த்தி செய்யப்பட்டால், திரவ மாதிரி 1:10, 1:100 அல்லது அதற்கு மேல் இருக்கும் 1:1,000,000 தேவைப்பட்டால், MilliQ டீயோனைஸ்டு தண்ணீரை பகுப்பாய்வுக்கு பயன்படுத்தவும்.
குறுக்கு-இணைப்பு எதிர்வினையில் (HA 2%, H2O, 1% NaOH மற்றும் 0.049 mM BDDE) பயன்படுத்தப்படும் தொடக்கப் பொருட்களுக்கு, இந்தப் பொருட்களிலிருந்து தயாரிக்கப்பட்ட ஒவ்வொரு மாதிரியின் 1 mL அதே பகுப்பாய்வு நிலைமைகளைப் பயன்படுத்தி பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது.
அயன் வரைபடத்தில் தோன்றும் சிகரங்களின் தனித்தன்மையைத் தீர்மானிக்க, 10 µL இன் 100 ppb BDDE நிலையான தீர்வு (Sigma-Aldrich Co) 20 µL மாதிரியில் சேர்க்கப்பட்டது.இந்த வழக்கில், ஒவ்வொரு மாதிரியிலும் தரத்தின் இறுதி செறிவு 37 பிபிபி ஆகும்.
முதலில், 990 μL MilliQ தண்ணீருடன் (அடர்த்தி 1.1 g/mL) 10 μL நிலையான BDDE (Sigma-Aldrich Co) ஐ நீர்த்துப்போகச் செய்வதன் மூலம் 11,000 mg/L (11,000 ppm) செறிவு கொண்ட BDDE ஸ்டாக் கரைசலை தயார் செய்யவும்.110 µg/L (110 ppb) BDDE கரைசலை ஒரு இடைநிலை நிலையான நீர்த்துப்போகச் செய்ய இந்தத் தீர்வைப் பயன்படுத்தவும்.பின்னர், 75, 50, 25, 10 மற்றும் 1 ppb இன் விரும்பிய செறிவை அடைய இடைநிலை நீர்த்தத்தை பல முறை நீர்த்துப்போகச் செய்வதன் மூலம் நிலையான வளைவைத் தயாரிக்க இடைநிலை BDDE நிலையான நீர்த்தத்தை (110 ppb) பயன்படுத்தவும்.படம் 1 இல் காட்டப்பட்டுள்ளபடி, 1.1 முதல் 110 பிபிபி வரையிலான BDDE நிலையான வளைவு நல்ல நேர்கோட்டுத்தன்மையைக் கொண்டுள்ளது (R2>0.99).நிலையான வளைவு நான்கு சுயாதீன சோதனைகளில் மீண்டும் மீண்டும் செய்யப்பட்டது.
படம் 1 BDDE நிலையான அளவுத்திருத்த வளைவு LC-MS பகுப்பாய்வு மூலம் பெறப்பட்டது, இதில் ஒரு நல்ல தொடர்பு காணப்படுகிறது (R2>0.99).
சுருக்கங்கள்: BDDE, 1,4-பியூட்டானெடியோல் டிக்லிசிடில் ஈதர்;LC-MS, திரவ குரோமடோகிராபி மற்றும் மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி.
குறுக்கு-இணைக்கப்பட்ட HA இல் உள்ள BDDE தரநிலைகள் மற்றும் அடிப்படை தீர்வுகளில் BDDE தரநிலைகளைக் கண்டறிந்து அளவிட, LC-MS பகுப்பாய்வு பயன்படுத்தப்பட்டது.
குரோமடோகிராஃபிக் பிரிப்பு LUNA 2.5 µm C18(2)-HST நெடுவரிசையில் (50×2.0 mm2; Phenomenex, Torrance, CA, USA) அடையப்பட்டது மற்றும் பகுப்பாய்வின் போது அறை வெப்பநிலையில் (25°C) வைக்கப்பட்டது.மொபைல் கட்டமானது அசிட்டோனிட்ரைல் (கரைப்பான் A) மற்றும் 0.1% ஃபார்மிக் அமிலம் கொண்ட நீர் (கரைப்பான் B) ஆகியவற்றைக் கொண்டுள்ளது.மொபைல் கட்டம் சாய்வு நீக்கம் மூலம் நீக்கப்பட்டது.சாய்வு பின்வருமாறு: 0 நிமிடங்கள், 2% A;1 நிமிடம், 2% A;6 நிமிடங்கள், 98% A;7 நிமிடங்கள், 98% A;7.1 நிமிடங்கள், 2% A;10 நிமிடங்கள், 2% A. இயங்கும் நேரம் 10 நிமிடங்கள் மற்றும் ஊசி அளவு 20 µL ஆகும்.BDDE இன் தக்கவைப்பு நேரம் சுமார் 3.48 நிமிடங்கள் (சோதனைகளின் அடிப்படையில் 3.43 முதல் 4.14 நிமிடங்கள் வரை).LC-MS பகுப்பாய்விற்காக மொபைல் கட்டம் 0.25 mL/min ஓட்ட விகிதத்தில் செலுத்தப்பட்டது.
BDDE பகுப்பாய்வு மற்றும் MS மூலம் அளவீடு செய்ய, UPLC அமைப்பு (வாட்டர்ஸ்) API 3000 டிரிபிள் குவாட்ரூபோல் மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமீட்டருடன் (AB SCIEX) ஒரு எலக்ட்ரோஸ்ப்ரே அயனியாக்கம் மூலத்துடன் இணைக்கப்பட்டுள்ளது, மேலும் பகுப்பாய்வு நேர்மறை அயனி பயன்முறையில் (ESI+) செய்யப்படுகிறது.
BDDE இல் செய்யப்பட்ட அயனி துண்டு பகுப்பாய்வின் படி, அதிக தீவிரம் கொண்ட துண்டு 129.1 Da (படம் 6) உடன் தொடர்புடைய துண்டு என தீர்மானிக்கப்பட்டது.எனவே, அளவீட்டுக்கான மல்டி-அயன் கண்காணிப்பு பயன்முறையில் (MIM), BDDE இன் வெகுஜன மாற்றம் (மாஸ்-டு-சார்ஜ் ரேஷியோ [m/z]) 203.3/129.1 Da ஆகும்.இது LC-MS பகுப்பாய்விற்கு முழு ஸ்கேன் (FS) பயன்முறை மற்றும் தயாரிப்பு அயன் ஸ்கேன் (PIS) பயன்முறையையும் பயன்படுத்துகிறது.
முறையின் தனித்தன்மையை சரிபார்க்க, ஒரு வெற்று மாதிரி (ஆரம்ப மொபைல் கட்டம்) பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது.203.3/129.1 Da என்ற வெகுஜன மாற்றத்துடன் வெற்று மாதிரியில் எந்த சமிக்ஞையும் கண்டறியப்படவில்லை.சோதனையின் மறுநிகழ்வு குறித்து, 55 ppb இன் 10 நிலையான ஊசிகள் (அளவுத்திருத்த வளைவின் நடுவில்) பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன, இதன் விளைவாக எஞ்சிய நிலையான விலகல் (RSD) <5% (தரவு காட்டப்படவில்லை).
மீதமுள்ள BDDE உள்ளடக்கம் நான்கு சுயாதீன சோதனைகளுடன் தொடர்புடைய எட்டு வெவ்வேறு ஆட்டோகிளேவ்டு BDDE குறுக்கு-இணைக்கப்பட்ட HA ஹைட்ரஜல்களில் அளவிடப்பட்டது."பொருட்கள் மற்றும் முறைகள்" பிரிவில் விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி, BDDE நிலையான நீர்த்தலின் பின்னடைவு வளைவின் சராசரி மதிப்பால் அளவீடு மதிப்பிடப்படுகிறது, இது BDDE வெகுஜன மாற்றமான 203.3/129.1 Da, தக்கவைப்புடன் கண்டறியப்பட்ட தனித்துவமான உச்சநிலைக்கு ஒத்திருக்கிறது. நேரம் 3.43 முதல் 4.14 நிமிடங்கள் வரை காத்திருக்கவில்லை.படம் 2 10 ppb BDDE குறிப்பு தரநிலையின் குரோமடோகிராம் உதாரணத்தைக் காட்டுகிறது.எட்டு வெவ்வேறு ஹைட்ரோஜெல்களின் எஞ்சிய BDDE உள்ளடக்கத்தை அட்டவணை 1 சுருக்கமாகக் கூறுகிறது.மதிப்பு வரம்பு 1 முதல் 2.46 பிபிபி வரை.எனவே, மாதிரியில் எஞ்சியிருக்கும் BDDE செறிவு மனித பயன்பாட்டிற்கு ஏற்கத்தக்கது (<2 ppm).
203.30/129.10 Da (நேர்மறை MRM பயன்முறையில்) LC-MS பகுப்பாய்வு மூலம் பெறப்பட்ட 10 ppb BDDE குறிப்பு தரநிலை (சிக்மா-ஆல்ட்ரிச் கோ), MS (m/z) மாற்றத்தின் படம் 2 அயன் குரோமடோகிராம்.
சுருக்கங்கள்: BDDE, 1,4-பியூட்டானெடியோல் டிக்லிசிடில் ஈதர்;LC-MS, திரவ குரோமடோகிராபி மற்றும் மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி;MRM, பல எதிர்வினை கண்காணிப்பு;எம்.எஸ்., நிறை;m/z, நிறை-க்கு-சார்ஜ் விகிதம்.
குறிப்பு: 1-8 மாதிரிகள் ஆட்டோகிளேவ் செய்யப்பட்ட BDDE குறுக்கு-இணைக்கப்பட்ட HA ஹைட்ரஜல்கள்.ஹைட்ரஜலில் BDDE இன் எஞ்சிய அளவு மற்றும் BDDE தக்கவைப்பு நேரத்தின் உச்சம் ஆகியவையும் தெரிவிக்கப்படுகின்றன.இறுதியாக, வெவ்வேறு தக்கவைப்பு நேரங்களைக் கொண்ட புதிய சிகரங்களின் இருப்பும் தெரிவிக்கப்படுகிறது.
சுருக்கங்கள்: BDDE, 1,4-பியூட்டானெடியோல் டிக்லிசிடில் ஈதர்;HA, ஹைலூரோனிக் அமிலம்;MRM, பல எதிர்வினை கண்காணிப்பு;tR, தக்கவைப்பு நேரம்;LC-MS, திரவ குரோமடோகிராபி மற்றும் மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி;RRT, உறவினர் தக்கவைப்பு நேரம்.
ஆச்சரியப்படும் விதமாக, LC-MS அயன் குரோமடோகிராமின் பகுப்பாய்வு, பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்ட அனைத்து ஆட்டோகிளேவ்டு கிராஸ்-இணைக்கப்பட்ட HA ஹைட்ரஜல் மாதிரிகளின் அடிப்படையில், 2.73 முதல் 3.29 நிமிடங்கள் வரை தக்கவைப்பு நேரத்தில் கூடுதல் உச்சம் இருந்தது என்பதைக் காட்டுகிறது.எடுத்துக்காட்டாக, படம் 3 குறுக்கு-இணைக்கப்பட்ட HA மாதிரியின் அயனி குரோமடோகிராம் காட்டுகிறது, அங்கு ஒரு கூடுதல் உச்சம் தோராயமாக 2.71 நிமிடங்கள் வெவ்வேறு தக்கவைப்பு நேரத்தில் தோன்றும்.BDDE இலிருந்து புதிதாகக் கவனிக்கப்பட்ட உச்சத்திற்கும் உச்சத்திற்கும் இடையில் கவனிக்கப்பட்ட உறவினர் தக்கவைப்பு நேரம் (RRT) 0.79 (அட்டவணை 1) என கண்டறியப்பட்டது.LC-MS பகுப்பாய்வில் பயன்படுத்தப்படும் C18 நெடுவரிசையில் புதிதாகக் கவனிக்கப்பட்ட உச்சம் குறைவாகத் தக்கவைக்கப்பட்டுள்ளது என்பதை நாங்கள் அறிந்திருப்பதால், புதிய உச்சமானது BDDE ஐ விட துருவ கலவையுடன் ஒத்திருக்கலாம்.
படம் 3 LC-MS (MRM மாஸ் கன்வெர்ஷன் 203.3/129.0 Da) மூலம் பெறப்பட்ட குறுக்கு-இணைக்கப்பட்ட HA ஹைட்ரஜல் மாதிரியின் அயன் குரோமடோகிராம்.
சுருக்கங்கள்: HA, ஹைலூரோனிக் அமிலம்;LC-MS, திரவ குரோமடோகிராபி மற்றும் மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி;MRM, பல எதிர்வினை கண்காணிப்பு;RRT, உறவினர் தக்கவைப்பு நேரம்;tR, தக்கவைப்பு நேரம்.
கவனிக்கப்பட்ட புதிய சிகரங்கள் முதலில் பயன்படுத்தப்பட்ட மூலப் பொருட்களில் உள்ள அசுத்தங்களாக இருக்கலாம் என்பதை நிராகரிப்பதற்காக, இந்த மூலப்பொருட்களும் அதே LC-MS பகுப்பாய்வு முறையைப் பயன்படுத்தி பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன.பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்ட தொடக்கப் பொருட்களில் நீர், தண்ணீரில் 2% NaHA, தண்ணீரில் 1% NaOH மற்றும் குறுக்கு-இணைக்கும் எதிர்வினையில் பயன்படுத்தப்படும் அதே செறிவில் BDDE ஆகியவை அடங்கும்.பயன்படுத்தப்படும் தொடக்கப் பொருளின் அயன் குரோமடோகிராம் எந்த கலவை அல்லது உச்சத்தையும் காட்டவில்லை, மேலும் அதன் தக்கவைப்பு நேரம் கவனிக்கப்பட்ட புதிய உச்சநிலைக்கு ஒத்திருக்கிறது.இந்த உண்மை, தொடக்கப் பொருளில் மட்டும் அல்லாமல், பகுப்பாய்வு செயல்முறையில் குறுக்கிடக்கூடிய கலவைகள் அல்லது பொருட்கள் இருக்கலாம், ஆனால் பிற ஆய்வக தயாரிப்புகளுடன் குறுக்கு-மாசுபாடு ஏற்படுவதற்கான எந்த அறிகுறியும் இல்லை.BDDE மற்றும் புதிய சிகரங்களின் LC-MS பகுப்பாய்வுக்குப் பிறகு பெறப்பட்ட செறிவு மதிப்புகள் அட்டவணை 2 (மாதிரிகள் 1-4) மற்றும் படம் 4 இல் உள்ள அயன் குரோமடோகிராம் ஆகியவற்றில் காட்டப்பட்டுள்ளன.
குறிப்பு: மாதிரிகள் 1-4 ஆனது ஆட்டோகிளேவ்டு BDDE குறுக்கு-இணைக்கப்பட்ட HA ஹைட்ரோஜெல்களை உற்பத்தி செய்யப் பயன்படுத்தப்படும் மூலப் பொருட்களுடன் ஒத்திருக்கிறது.இந்த மாதிரிகள் ஆட்டோகிளேவ் செய்யப்படவில்லை.
சுருக்கங்கள்: BDDE, 1,4-பியூட்டானெடியோல் டிக்லிசிடில் ஈதர்;HA, ஹைலூரோனிக் அமிலம்;LC-MS, திரவ குரோமடோகிராபி மற்றும் மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி;MRM, பல எதிர்வினை கண்காணிப்பு.
HA மற்றும் BDDE இன் குறுக்கு-இணைப்பு எதிர்வினையில் பயன்படுத்தப்படும் மூலப்பொருளின் மாதிரியின் LC-MS குரோமடோகிராமுடன் படம் 4 ஒத்துள்ளது.
குறிப்பு: இவை அனைத்தும் ஒரே செறிவு மற்றும் விகிதத்தில் குறுக்கு-இணைப்பு எதிர்வினையை மேற்கொள்ள பயன்படுத்தப்படுகின்றன.குரோமடோகிராம் மூலம் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்ட மூலப்பொருட்களின் எண்கள் பின்வருமாறு: (1) நீர், (2) 2% HA அக்வஸ் கரைசல், (3) 1% NaOH அக்வஸ் கரைசல்.LC-MS பகுப்பாய்வு 203.30/129.10 Da (நேர்மறை MRM பயன்முறையில்) வெகுஜன மாற்றத்திற்காக செய்யப்படுகிறது.
சுருக்கங்கள்: BDDE, 1,4-பியூட்டானெடியோல் டிக்லிசிடில் ஈதர்;HA, ஹைலூரோனிக் அமிலம்;LC-MS, திரவ குரோமடோகிராபி மற்றும் மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி;MRM, பல எதிர்வினை கண்காணிப்பு.
புதிய சிகரங்கள் உருவாக வழிவகுத்த நிலைமைகள் ஆய்வு செய்யப்பட்டன.குறுக்கு-இணைக்கப்பட்ட HA ஹைட்ரஜலை உருவாக்கப் பயன்படுத்தப்படும் எதிர்வினை நிலைமைகள் BDDE குறுக்கு-இணைக்கும் முகவரின் வினைத்திறனை எவ்வாறு பாதிக்கின்றன என்பதைப் படிப்பதற்காக, புதிய சிகரங்களை உருவாக்குவதற்கு வழிவகுத்தது (சாத்தியமான துணை தயாரிப்புகள்), வெவ்வேறு அளவீடுகள் செய்யப்பட்டன.இந்தத் தீர்மானங்களில், இறுதி BDDE கிராஸ்லிங்கரைப் படித்து பகுப்பாய்வு செய்தோம், இது NaOH இன் வெவ்வேறு செறிவுகளுடன் (0%, 1%, 0.1% மற்றும் 0.01%) நீர்நிலை ஊடகத்தில் சிகிச்சை செய்யப்பட்டது, அதைத் தொடர்ந்து அல்லது ஆட்டோகிளேவிங் இல்லாமல்.அதே நிலைமைகளை உருவகப்படுத்துவதற்கான பாக்டீரியா செயல்முறை குறுக்கு-இணைக்கப்பட்ட HA ஹைட்ரஜலை உருவாக்கப் பயன்படுத்தப்படும் முறையைப் போன்றது."பொருட்கள் மற்றும் முறைகள்" பிரிவில் விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி, மாதிரியின் வெகுஜன மாற்றம் LC-MS ஆல் 203.30/129.10 Da என பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது.BDDE மற்றும் புதிய உச்சத்தின் செறிவு ஆகியவை கணக்கிடப்பட்டு, முடிவுகள் அட்டவணை 3 இல் காட்டப்பட்டுள்ளன. கரைசலில் NaOH இருந்தபோதிலும், ஆட்டோகிளேவ் செய்யப்படாத மாதிரிகளில் புதிய சிகரங்கள் எதுவும் கண்டறியப்படவில்லை (மாதிரிகள் 1-4, அட்டவணை 3)ஆட்டோகிளேவ் செய்யப்பட்ட மாதிரிகளுக்கு, கரைசலில் NaOH முன்னிலையில் மட்டுமே புதிய சிகரங்கள் கண்டறியப்படுகின்றன, மேலும் உச்சத்தின் உருவாக்கம் கரைசலில் உள்ள NaOH செறிவைப் பொறுத்தது (மாதிரிகள் 5-8, அட்டவணை 3) (RRT = 0.79).படம் 5 ஒரு அயன் குரோமடோகிராமின் உதாரணத்தைக் காட்டுகிறது, NAOH இன் முன்னிலையில் அல்லது இல்லாத நிலையில் இரண்டு ஆட்டோகிளேவ் செய்யப்பட்ட மாதிரிகளைக் காட்டுகிறது.
சுருக்கங்கள்: BDDE, 1,4-பியூட்டானெடியோல் டிக்லிசிடில் ஈதர்;LC-MS, திரவ குரோமடோகிராபி மற்றும் மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி;MRM, பல எதிர்வினை கண்காணிப்பு.
குறிப்பு: மேல் குரோமடோகிராம்: மாதிரியானது 0.1% NaOH அக்வஸ் கரைசலுடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்டது மற்றும் ஆட்டோகிளேவ் செய்யப்பட்டது (20 நிமிடங்களுக்கு 120 ° C).கீழே உள்ள குரோமடோகிராம்: மாதிரி NaOH உடன் சிகிச்சையளிக்கப்படவில்லை, ஆனால் அதே நிலைமைகளின் கீழ் ஆட்டோகிளேவ் செய்யப்பட்டது.203.30/129.10 Da (நேர்மறை MRM பயன்முறையில்) வெகுஜன மாற்றம் LC-MS ஆல் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது.
சுருக்கங்கள்: BDDE, 1,4-பியூட்டானெடியோல் டிக்லிசிடில் ஈதர்;LC-MS, திரவ குரோமடோகிராபி மற்றும் மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி;MRM, பல எதிர்வினை கண்காணிப்பு.
அனைத்து ஆட்டோகிளேவ் செய்யப்பட்ட மாதிரிகளிலும், NaOH உடன் அல்லது இல்லாமல், BDDE செறிவு வெகுவாகக் குறைக்கப்பட்டது (16.6 மடங்கு வரை) (மாதிரிகள் 5-8, அட்டவணை 2).BDDE செறிவு குறைவதன் காரணமாக, அதிக வெப்பநிலையில், BDDE இன் எபோக்சைடு வளையத்தைத் திறந்து 1,2-டையோல் கலவையை உருவாக்குவதற்கு நீர் ஒரு தளமாக (நியூக்ளியோஃபைல்) செயல்பட முடியும்.இந்த சேர்மத்தின் மோனோஐசோடோபிக் தரம் BDDE இலிருந்து வேறுபட்டது, எனவே பாதிக்கப்படாது.LC-MS ஆனது 203.30/129.10 Da வெகுஜன மாற்றத்தைக் கண்டறிந்தது.
இறுதியாக, இந்த சோதனைகள் புதிய சிகரங்களின் உருவாக்கம் BDDE, NAOH மற்றும் ஆட்டோகிளேவிங் செயல்முறையின் இருப்பைப் பொறுத்தது, ஆனால் HA உடன் எந்த தொடர்பும் இல்லை என்பதைக் காட்டுகிறது.
ஏறக்குறைய 2.71 நிமிடங்கள் தக்கவைத்துக்கொள்ளும் நேரத்தில் கண்டுபிடிக்கப்பட்ட புதிய உச்சம் பின்னர் LC-MS ஆல் வகைப்படுத்தப்பட்டது.இந்த நோக்கத்திற்காக, BDDE (9.9 mg/mL) 1% NaOH அக்வஸ் கரைசலில் அடைகாக்கப்பட்டு ஆட்டோகிளேவ் செய்யப்பட்டது.அட்டவணை 4 இல், புதிய உச்சத்தின் பண்புகள் அறியப்பட்ட BDDE குறிப்பு உச்சத்துடன் ஒப்பிடப்படுகின்றன (தக்க நேரம் தோராயமாக 3.47 நிமிடங்கள்).இரண்டு சிகரங்களின் அயனி துண்டு துண்டான பகுப்பாய்வின் அடிப்படையில், 2.72 நிமிடங்கள் தக்கவைக்கும் நேரத்துடன் கூடிய உச்சமானது BDDE உச்சத்தின் அதே துண்டுகளைக் காட்டுகிறது, ஆனால் வெவ்வேறு தீவிரங்களுடன் (படம் 6) முடிவு செய்யலாம்.2.72 நிமிடங்களின் தக்கவைப்பு நேரத்துடன் (PIS) தொடர்புடைய உச்சத்திற்கு, 147 Da வெகுஜனத்தில் துண்டு துண்டான பிறகு மிகவும் தீவிரமான உச்சம் காணப்பட்டது.இந்த தீர்மானத்தில் பயன்படுத்தப்படும் BDDE செறிவில் (9.9 mg/mL), புற ஊதா நிறமாலையில் வெவ்வேறு உறிஞ்சுதல் முறைகள் (UV, λ=200 nm) குரோமடோகிராஃபிக் பிரிப்புக்குப் பிறகும் காணப்பட்டன (படம் 7).2.71 நிமிடங்கள் தக்கவைக்கும் நேரத்துடன் கூடிய உச்சம் இன்னும் 200 nm இல் தெரியும், அதே நிலையில் BDDE உச்சத்தை குரோமடோகிராமில் காண முடியாது.
அட்டவணை 4 புதிய உச்சத்தின் குணாதிசய முடிவுகள் சுமார் 2.71 நிமிடங்கள் மற்றும் BDDE உச்சம் 3.47 நிமிடங்கள் தக்கவைப்பு நேரம்
குறிப்பு: இந்த முடிவுகளைப் பெற, இரண்டு சிகரங்களில் LC-MS மற்றும் HPLC பகுப்பாய்வுகள் (MRM மற்றும் PIS) செய்யப்பட்டன.HPLC பகுப்பாய்விற்கு, 200 nm அலைநீளத்துடன் UV கண்டறிதல் பயன்படுத்தப்படுகிறது.
சுருக்கங்கள்: BDDE, 1,4-பியூட்டானெடியோல் டிக்லிசிடில் ஈதர்;HPLC, உயர் செயல்திறன் திரவ நிறமூர்த்தம்;LC-MS, திரவ குரோமடோகிராபி மற்றும் மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி;MRM, பல எதிர்வினை கண்காணிப்பு;m/z, நிறை-க்கு-சார்ஜ் விகிதம்;பிஐஎஸ், தயாரிப்பு அயன் ஸ்கேனிங்;புற ஊதா ஒளி, புற ஊதா ஒளி.
குறிப்பு: வெகுஜன துண்டுகள் LC-MS பகுப்பாய்வு (PIS) மூலம் பெறப்படுகின்றன.மேல் குரோமடோகிராம்: BDDE நிலையான மாதிரி துண்டுகளின் நிறை நிறமாலை.பாட்டம் குரோமடோகிராம்: கண்டறியப்பட்ட புதிய உச்சத்தின் நிறை ஸ்பெக்ட்ரம் (BDDE உச்சத்துடன் தொடர்புடைய RRT 0.79 ஆகும்).BDDE 1% NaOH கரைசலில் செயலாக்கப்பட்டு ஆட்டோகிளேவ் செய்யப்பட்டது.
சுருக்கங்கள்: BDDE, 1,4-பியூட்டானெடியோல் டிக்லிசிடில் ஈதர்;LC-MS, திரவ குரோமடோகிராபி மற்றும் மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி;MRM, பல எதிர்வினை கண்காணிப்பு;பிஐஎஸ், தயாரிப்பு அயன் ஸ்கேன்;RRT, உறவினர் தக்கவைப்பு நேரம்.
படம் 7 203.30 Da முன்னோடி அயனியின் அயன் குரோமடோகிராம், மற்றும் (A) 2.71 நிமிடங்கள் தக்கவைக்கும் நேரத்துடன் புதிய உச்சம் மற்றும் (B) 200 nm இல் 3.46 நிமிடங்களில் BDDE குறிப்பு நிலையான உச்சத்தின் UV கண்டறிதல்.
தயாரிக்கப்பட்ட அனைத்து குறுக்கு-இணைக்கப்பட்ட HA ஹைட்ரோஜெல்களிலும், LC-MS அளவீட்டிற்குப் பிறகு மீதமுள்ள BDDE செறிவு <2 ppm ஆக இருந்தது, ஆனால் பகுப்பாய்வில் ஒரு புதிய அறியப்படாத உச்சநிலை தோன்றியது.இந்த புதிய உச்சநிலை BDDE நிலையான தயாரிப்புடன் பொருந்தவில்லை.BDDE நிலையான தயாரிப்பும் நேர்மறை MRM பயன்முறையில் அதே தர மாற்றத்திற்கு உட்பட்டது (MRM மாற்றம் 203.30/129.10 Da) பகுப்பாய்வு.பொதுவாக, குரோமடோகிராபி போன்ற பிற பகுப்பாய்வு முறைகள் ஹைட்ரோஜெல்களில் BDDE ஐக் கண்டறிய வரம்பு சோதனைகளாகப் பயன்படுத்தப்படுகின்றன, ஆனால் அதிகபட்ச கண்டறிதல் வரம்பு (LOD) 2 ppm ஐ விட சற்று குறைவாக உள்ளது.மறுபுறம், இதுவரை, குறுக்கு-இணைக்கப்பட்ட HA தயாரிப்புகளின் சர்க்கரை அலகு துண்டுகளில் HA இன் குறுக்கு-இணைப்பு மற்றும்/அல்லது மாற்றத்தின் அளவை வகைப்படுத்துவதற்கு NMR மற்றும் MS பயன்படுத்தப்பட்டுள்ளன.இந்தக் கட்டுரையில் நாம் விவரிப்பது போல் எஞ்சிய BDDE கண்டறிதலை இவ்வளவு குறைந்த செறிவுகளில் அளவிடுவதே இந்த நுட்பங்களின் நோக்கம் அல்ல (எங்கள் LC-MS முறையின் LOD = 10 ppb).